Kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan bentuk kromatografi planar, selain kromatografi kertas dan elektroforesis. KLT merupakan metode pemisahan campuran analit dengan mengelusi analit melalui suatu lempeng kromatografi lalu melihat komponen/analit yang terpisah dengan penyemprotan atau pengecatan. Dalam bentuknya yang paling sederhana, lempeng-lempeng KLT dapat disiapkan di laboratorium, lalu lempeng diletakkan dalam wadah dengan ukuran yang sesuai, lalu kromatogram hasil dapat discanning secara visual. Dalam bentuk yang lebih canggih, terdapat berbagai jenis lempeng KLT, teknik penotolan sampel, termasuk alat penotol sampel yang telah diotomatisasi, tempat pengembangan, alat pendeteksi, serta penjerap (fase diam) yang banyak tersedia di pasaran dengan berbagai jenis. Berbeda dengan kromatografi kolom yang mana fase diamnya diisikan atau dikemas di dalamnya, pada kromatografi lapis tipis, fase diamnya berupa lapisan yang seragam (uniform) pada permukaan bidang datar yang didukung oleh lempeng kaca, lempeng aluminium, atau lempeng plastik. Meskipun demikian, kromatofrafi planar ini dapat dikatakan sebagai bentuk terbuka dari kromatografi kolom.

Fase gerak yang dikenal sebagai pelarut pengembang akan bergerak sepanjang fase diam karena pengaruh kapiler pada pengembangan secara menaik (ascending), atau karena pengaruh graitasi pada pengembangan secara menurun (descending). KLT dalam pelaksanaannya lebih mudah dan lebih murah dibandingkan dengan kromatografi kolom. Demikian juga peralatan yang digunakan. Dalam KLT, peralatan yang digunakan lebih sederhana dan dapat dikatakan bahwa hampir semua laboratorium dapat melaksanakan setiap saat secara cepat. Beberapa keuntungan KLT adalah: (1) KLT banyak digunakan untuk tujuan analisis; (2) identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna, fluoresensi, atau dengan radiasi menggunakan sinar ultra violet;(3) dapat dilakukan elusi secara menaik (ascending), menurun (descending), atau dengan cara elusi 2 dimensi; dan (4) ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak.

Teori Dan Prinsip

Gambaran utama yang mengatur kemampuan daya pisah lempeng KLT adalah ukuran bercak (spot) dan dimensi fisik lempeng, dengan diameter sebesar 0,5 cm dan panjang lempeng pada umumnya 10 cm. Dengan ukuran seperti ini, lempeng hanya mampu memisahkan 20 analit secara optimal supaya terpisah secara sempurna. Meskipun demikian, dengan penghantaran kapiler normal eluat, maka lempeng teoretis maksimum adalah < 5.000. Kecepatan fase gerak bervariasi di sepanjang lempeng KLT. Semakin jauh fase gerak melewati lempeng maka kecepatannya akan menurun.

Koefisien distribusi suatu komponen didefinisikan sebagai perbandingan konsentrasi solut dalam fase diam (Cs) dan dalam fase gerak (Cm),

K = Cs/Cm

K menggambarkan afinitas relatif komponen dalam kedua fase, karenanya terkait dengan kecepatan dan jarak yang ditempuh oleh komponen yang akan dipisahkan dalam lempeng KLT. Meskipun demikian, koefisien distribusi dan kecepatan migrasi sukar diukur, karenanya diperlukan evaluasi kromatogram yang lebih praktis. Dalam KLT dan juga kromatografi kertas, hasil-hasil yang diperoleh digambarkan dengan mencantumkan nilai Rf-nya yang merujuk pada migrasi relatif analit terhadap ujukng depan fase gerak atau eluen, dan nilai ini terkait dengan koefisien distribusi komponen. Nilai Rf didefinisikan sebagai:

Rf = Jarak yang ditempuh solut / Jarak yang ditempuh fase gerak

Nilai Rf ini terkait dengan faktor perlambatan. Nilai Rf bukanlah suatu nilai fisika absolut untuk suatu komponen; meskipun demikian, dengan pengendalian kondisi KLT secara hati-hati, nilai Rf dapat digunakan sebagai cara untuk identifikasi kualitatif. Disebabkan oleh banyaknya variabel yang berpengaruh pada nilai Rf -misalnya adanya sedikit perbedaan komposisi fase gerak, suhu, ukuran chamber, lapusan penjerap, dan sifat campuran- maka penentuan nilai Rf dalam suatu sistem KLT yang berbeda merupakan cara yang harus dilakukan ketika melakukan identifikasi untuk membuktikan adanya suatu komponen/analit yang dituju dalam sampel.

Penjerap/Fase diam KLT

Sifat-sifat umum penjerap pada KLT harus serupa dengan sifat-sifat pada penjerap dalam kromatografi kolom (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi dan Kromatografi Gas). Dua sifat penjerap yang penting adalah ukuran partikel dan fase diam yang digunakan dalam KLT merupakan penjerap berukuran kecil dengan diameer partikel antara 10=30 μm. Semakin kecil ukuran rata-rata partikel fase diam dan semakin sempit kisaran ukuran fase diam, maka semakin baik kinerja KLT dalam hal efisiensinya dan resolusinya.

Penjerap yang paling sering digunakan adalah silika dan serbuuk selulosa, sementara mekanisme sorpsi-desorpsi (perpindahan analit dan fase diam ke fase gerak dan sebaliknya) yang utama pada KLT adala partisi dan adsorpsi. Lapisan tipis yang digunakan sebagai penjerap juga dapat dibuat dari silika yang telah dimodifikasi, resin penukar ion, gel eksklusi, dan siklodekstrin yang digunakan untuk pemisahan kkiral Beberapa penjerap KLT serupa dengan penjerap yang digunakan pada KCKT. Kebanyakan penjerap dikontrol keajegan ukuran partikel dan luas permukaan. Berikut merupakan ringkasan beberapa penjerap (fase diam) yang sering digunakan dalam kromatografi lapis tipis beserta mekanisme pemisahannya, serta penggunaannya untuk analisis:

• Silika Gel
  Mekanisme sorpsi: Adsorpsi
  Penggunaan: Asam amino, hidrokarbon, vitamin, alkaloid.
• Silika yang dimodifikasi dengan hidrokarbon
  Mekanisme sorpsi: Partisi termodifikasi
  Penggunaan: Senyawa-senyawa non-polar.
• Serbuk selulosa
  Mekanisme sorpsi: Partisi
  Penggunaan: Asam amino, nukleotida, karbohidrat.
• Alumina
  Mekanisme sorpsi: Adsorpsi
  Penggunaan: Hidrokarbon, ion logam, pewarna makanan, alkaloid.
• Kieselguhr (tanah Diatomae)
  Mekanisme sorpsi: Partisi
  Penggunaan: Gula, asam-asam lemak.
• Selulosa penukar ion
  Mekanisme sorpsi: pertukaran ion
  Penggunaan: Asam nukleat, nukleotida, halida dan ion-ion logam.
• Gel sephadex
  Mekanisme sorpsi: eksklusi
  Penggunaan: Polimer, protein, kompleks logam.
• β-siklodekstrin
  Mekanisme sorpsi: Interaksi adsorpsi stereospesifik
  Penggunaan: Campuran enantiomer.

Lempeng KLT disiapkan dengan melapiskan penjerap ke permukaan lapisan kaca, gelas, atau aluminium dengan ketebalan 250 μm. Lempeng KLT telah tersedia di pasaran dengan berbagai ukuran dan telah ditambah dengan reagen fluoresen untuk memfasilitasi deteksi bercak solut. Di samping itu, lempeng KLT yang tersedia di pasaran sudah ditambah dengan agen pengikat, seperti kalsium sulfat.

Fase Gerak pada KLT

pemisahan pada KLT dikendalikan oleh rasio distribusi komponen dalam sistem fase diam/penjerap dan eluen tertentu. Profil pemisahan pada KLT dapat dimodifikasi dengan mengubah komposisi fase gerak dengan memperhatikan polaritas dan kekuatan elusinya.

Fase gerak pada KLT dapat dipilih dari pustaka, tetapi lebih sering dengan mencoba-coba karena waktu yang diperlukan hanya sebentar. Sistem yang paling sederhana ialah campuran 2 pelarut organik karena daya elusi campuran kedua pelarut ini dapat mudah diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal. Berikut adalah beberapa petunjuk dalam memilih dan mengoptimasi fase gerak:

• Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT merupakan teknik yang sensitif.
• Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf terletak antara 0,2-0,8 untuk memaksimalkan pemisahan.
• Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silika gel, polaritas fase gerak akan menentukan kecepatan migrasi solut yang berarti juga menentukan nilai Rf. Penambahan pelarut yang bersifat sedikit polar seperti dietil eter ke dalam pelarut non polar seperti metil benzen akan meningkatkan harga Rf secara signifikan.
• Solut-solut ionik dan solut-solut polar lebih baik digunakan campuran pelarut sebagai fase geraknya seperti campuran air dan menatol dengan perbandingan tertentu. Penambahan sedikit asam etanoat atau amonia masing-masing akan meningkatkan solut-solut yang bersifat basa dan asam.

Pelarut/fase gerak yang digunakan harus cukup murah, karena biasanya sejumlah besar fase gerak digunakan untuk elusi. Pelarut yang digunakan pada fase gerak KLT harus berupa pelarut dengan kemurnian yang tinggi.

Aplikasi (Penotolan) sampel

Sampel harus diaplikasikan/ditotolkan pada lempeng KLT dengan sangat hati-hati dengan pertimbangan bahwa gangguan yang mungkin timbul pada lempeng KLT dikendalikan sekecil mungkin. Pada umumnya, sampel secara manual ditotolkan melalui pipa kapiler, mikropilet atau melalui penyuntik mikro kaca yang telah terkalibrasi sedemikian rupa sehingga tetesan yang datang tepat menyentuh permukaan lempeng, sementra ujung alat penotol masih tetap di atas penjerap lempeng KLT.

Pemisahan pada kromatografi lapis tipis yang optimal akan diperoleh hanya jika menotolkan sampel dengan ukuran bercak sekecil dan sesempit mungkin. Sebagaimana dalam prosedur kromatografi yang lain, jika sampel yang digunakan terlalu banyak maka akan menurunkan resolusi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa penotolan sampel secara otomatis lebih dipilih daripada penotolan secara manual terutama jika sampel yang akan ditotolkan lebih dari 15 μl. Penotolan sampel yang tidak tepat akan menyebabkan bercak yang menyebar dan puncak ganda. Berdasarkan pada tujuan analisis, berbagai macam jumlah sampel telah disarankan untuk digunakan. Metode penotolan sampel secara otomatis diperlukan untuk menghasilkan reprosudibilitas yang baik, yang tentunya diperlukan untuk analisis kuantitatif.

Untuk memperoleh reprodusibilitas, volume sampel yang ditotolkan paling sedikit 0,5 μl. Jika volume sampel yang akan ditotolkan lebih besar dari 2-10 μl maka penotolan harus dilakukan secara bertahap dengan dilakukan pengeringan antar totolan. Jarak antar pusat penotolan bercak sebaiknya lebih dari 1 cm, bercak sebaiknya berdiameter antara 2-5 mm dan tidak terlalu dekat dengan ujung lempeng (sebaiknya jaraknya 1,5 cm dari ujung pada lempeng 20 × 20 cm).

Pengembangan KLT

Bila sampel telah ditotolkan, maka tahap selanjutnya adalah mengembangkan sampel tersebut dalam suatu bejana kromatografi yang sebelumnya telah dijenuhi dengan uap fase gerak. Tujuan penjenuhan bejana kromatografi (pencapaian kesetimbangan) adalah untuk memperoleh homogenitas atmosferik dalam bejana, dengan demikian meminimalkan penguapan pelarut dari lempeng KLT selama pengembangan. Tepi bagian bawah lempeg lapis tipis yang telah ditotoli sampel dicelupkan ke dalam fase gerak kurang lebih 0,5-1 cm. Tinggi fase gerak dalam bejana harus dibawah lempeng yang telah berisi totolan sampel.

Bejana kromatografi harus tertutup rapat dan sedapat mungkin volume fase gerak sedikit mungkin (akan tetapi harus mampu mengelusi lempeng sampai ketinggian lempeng yang telah ditentukan). Untuk melakukan penjenuhan fase gerak, biasanya bejana dilapisi dengan kertas saring. Jika fase gerak telah mencapai ujung atas kertas saring, maka dapat dikatakan bahwa fase gerak telah jenuh. Selama proses elusi, bejana kromatografi harus ditutup rapat, misalkan dengan lembar aluminium dan sebagainya.

Ada beberapa teknik untuk melakukan pengembangan dalam kromatografi lapis tipis, yaitu pengembangan menaik (ascending), menurun (descending), melingkat, dan mendatar. Meskipun demikian, cara pengembangan menaik merupakan cara yang paling populer dibandingkan dengan cara yang lain.

Deteksi Bercak

Suksesnya pemisahan secara kromatografi lapis tipis tergantung pada proses lokalisasi bercak. Untuk deteksi bercak yang berwarna, maka dapat dipisahkan secara visual. Bercak pemisahan pada KLT umumnya merupakan bercak yang tidak berwarna. Untuk penentuannya dapat dilakukan secara kimia, fisika, maupun biologi. Cara kimia yang biasa digunakan adalah dengan mereaksikan bercak dengan suatu pereaksi melalui cara penyemprotan sehingga bercak menjadi jelas. Cara fisika yang dapat digunakan untuk menampakkan bercak adalah dengan pencacahan radioaktif dan fluoresensi menyebabkan ultraviolet. Fluoresensi sinar ultraviolet terutama untuk senyawa yang daapt berfluoresensi maka bercak akan terlihat jelas. Jika senyawa tidak dapat berfluoresensi maka bahan penyerapnya diberi indikator yang berfluoresensi, dengan demikian bercak akan kelihatan hitam sedang latar belakangnya akan kelihatan berfluoresensi. Berikut adalah cara-cara kimiawi untuk mendeteksi bercak:

• Menyemprot lempeng KLT dengan reagen kromogenik yang akan bereaksi secara kimia dengan seluruh solut yang mengandung gugus fungsional tertentu sehingga bercak menjadi berwarna. Kadang-kadang lempeng dipanaskan terlebih dahulu untuk mempercepat reaksi pembentukan warna dan untuk meningkatkan intensitas warna bercak.
• Mengamati lempeng di bawah lampu ultra violet yang dipasang pada panjang gelombang emisi 254 atau 366 untuk menampakkan solut sebagai bercak yang gelap atau bercak yang berfluoresensi terang pada dasar yang berfluoresensi seragam. Lempeng yang diperdagangkan dapat dibeli dalam bentuk lempeng yang sudah diberi dengan senyawa fluoresen yang tidak larut yang dimasukkan ke dalam fase diam untuk memberikan dasar fluoresensi atau dapat pula dengan menyemprot lempeng dengan reagen fluorogenik setelah dilakukan pengembangan.
• Menyemprot lempeng dengan asam sulfat pekat atau asam nitrat pekat diikuti pemanasan untuk mengoksidasi solut-solut organik yang akan nampak sebagai bercak hitam sampai kecoklatan.
• Memaparkan lempeng dengan uap iodium dalamchamber tertutup
• Melakukanscanning pada permukaan lempeng dengan densitometer, suatu instrumen yang dapat mengukur intensitas radiasi dan direfleksikan dari permukaan lempeng ketika disinari dengan lampu UV atau lampu sinar tampak. Solut-solut yang mampu menyerap sinar akan dicatat seabgai puncak (peak) dalam pencatat (recorder).

Kromatografi Lapis Tipis Kinerja TInggi (KLT-KT)

KLT-KT atau high performance thin lajer chromatogrphy (HPTLC) dimaksudkan untuk mendapatkan pemisahan dan hasil analisis yang lebih baik dibanding dengan KLT biasa. Kelebihan KLT-KT dibanding dengan KLT terletak pada fase diamnya yang mana pada KLT-KT ini, fase diam yang digunakan berukuran sangat halus dan pori-porinya seragam serta tebal lapisannya hanya 0,1 mm. Ukuran partikel fase yang lebih kecil ini akan menyebabkan semakin besarnya jumlah lempeng teoritis, karenanya pemisahan menjadi lebih efisien.

Keunggulan KLT-KT lainnya adalah bahwa sampel yang digunakan hanya sedikit sehingga bercak penotolannya berdiameter antara 0,1-0,5 mm. Lempeng dengan 10 × 10 cm sudah cukup untuk analisis, karenanya pada KLT-KT ini juga lebih menghemat fase gerak dibanding dengan KLT-konvensional. Penyaiapn sampel pada KLT-KT serta pemilihan fase geraknya dapat dikatakan tidak ada perbedaan dengan KLT, hanya saja konsentrasi sampel pada KLT-KT ini lebih kecil dibanding dengan KLT biasa. Pada KLT-KT, resolusi sudah akan nampak nyata pada jarak pengembangan sampel antara 3-6 cm.

Penggunaan KLT

KLT, dan termasuk juga HPTLC, digunakan secara luas untuk analisis solut-solut organik terutama dalam bidang biokimia, farmasi, klinis, forensik, baik untuk analisis kualitatif dengan cara membandingkan nilai Rf solut dengan Rf senyawa baku atau untuk analisis kualitatif. Penggunaan umum KLT adalah untuk: menentukan banyaknya komponen dalam campuran, identifikasi senyawa, memantau berjalannya suatu reaksi, menentukan efektifitas pemurnian, menentukan kondisi yang sesuai untuk kromatografi kolom, serta untuk memantau kromatografi kolom, dan melakukan screening sampel untuk obat dan klinis.

1. Analisis KualitatifKLT dapat digunakan untuk uji identifikasi senyawa baku. Parameter pada KLT yang digunakan untuk identifikasi adalah nilai Rf. Dua senyawa dikatakan identik jika mempunyai nilai Rf yang sama jika diukur pada kondisi KLT yang sama. Untuk meyakinkan identifikasi dapat dilakukan dengan menggunakan senyawa baku yang sudah diketahui sangat dianjurkan untuk lebih memantapkan pengambilan keputusan identifikasi senyawa.
2. Analisis KuantitatifAda 2 cara yang digunakan untuk analisis kuantitatif dengan KLT. Pertama, bercak diukur langsung pada lempeng dengan menggunakan ukuran luas atau dengan teknik densitometri. Cara kedua adalah dengan mengerok bercak lalu menetapkan kadar senyawa yang terdapat dalam bercak tersebut dengan metode analisis yang lain, misalkan dengan metode spektrofotometri. Pada cara pertama tidak terjadi keaslahan yang disebbkan oleh pemindahan bercak atau kesalahan ekstraksi, sementara pada cara kedua sangat mungkin terjadi kesalahan karena pengambilan atau karena ekstraksi. ANalisis kuantitatif dari suatu senyawa yang telah dipisahkan dengan KLT biasanya dilakukan dengan densitometer yang langsung pada lempeng KLT (atau secara in situ). Densitometer dapat bekerja secara serapan atau fluoresensi. Kebanyakan densitometer mempunyai sumber cahaya, monokromator untuk memilih panjang gelombang yang cocok, sistem untuk memfkuskan sinar pada lempeng, pengganda foton, dan rekorder.
3. Pada sistem serapan dapat dilakukan dengan model pantulan atau transmisi. Pada cara pantulan, yang diukur adalah sinar yang dipantulkan, yang dapat menggunakan sinar tampak maupun ultraviolet. Sementara itu, cara transmisi dilakukan dengan menyinari bercak dari satu sisi dan mengukur sinar yang diteruskan pada sis lain. Pada kenyataannya, hanya sinar tampak yang dapat digunakan untuk metode ini. Gangguan utama pada sistem serapan adalah fluktuasi latar belakang (background) yang dapat dikurangi dengan beberapa cara, misalnya dengan menggunakan alat berkas ganda, sistem transmisi dan pantulan secara bersamaan, atau dengan sistem dua panjang gelombang. Kurv abaku dibuat untuk setiap lempeng dan kadar senyawa dihitung seperti pada metode instrumental yang lain. Presisi penetapan termasuk penotolan cuplikan, pengembangan kromatogram, dan pengukuran adalah 2-5 %. Sistem fluoresensi biasanya lebih disenangi jika senyawa itu dapat dibuat berfluoresensi. Batas deteksi sistem ini lebih rendah serta seletikfitasnya lebih tinggi. Gangguan fluktuasi latar belakang juga lebih rendah. Bercak yang diukur dengan sistem fluoresensi, serapan ultraviolet, atau sinar tampak dapat ditetapkan lebih teliti daripada bercak yang disemprot dengan pereaksi warna. Faktor keseragama pada penyemprotan merupakan hal yang sangat menentukan. Semua pekerjaan KLT jika ditunjukkan untuk analisis kuantitatif harus dilakukan dengan seksama. Alat yang digunakan untuk mengambil sampel harus terkalibrasi dengan baik. Saat ini tersedia alat penotol sampel kapiler yang berukuran antara 1 sampai 100 μL. Pada saat menotolkan sampel, kapiler harus tegak lurus dengan lempeng dan semua sampel harus dikeluarkan dari kapiler.
4. Analisis Preparatif
   Analisis preparatif ditujukan untuk memisahkan analit dalam jumlah yang banyak lalu senyawa yang telah dipisahkan ini dianalisis lebih lanjut, misalkan dengan spektrofotometri atau dengan tekno kromatografi lain. Pada KLT preparatif ini, sampel ditotolkan dalam lempeng dengan lapisan destruktif. Bercak yang mengandung analit yang dituju selanjutnya dikerik dan dilakukan analisis lebih lanjut.

Sumber: Analisis Obat secara Spektrofotometri dan Kromatografi (2012)
Prof. Dr. Ibnu Gholib Gandjar, DEA., Apt Dr. Abdul Rohman, M.Si., Apt
Penerbit: Pustaka Pelajar